ИФА-подобный анализ микроРНК с применением изотермической амплификации
Бодулев О.Л., Соловьев А.М., Сахаров И.Ю.
Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
Abstract
МикроРНК - РНК-олигонуклеотиды, принимающие участие в регуляции активности генов животных и растений. Обнаружена взаимосвязь между изменением концентрации различных микроРНК в биоматериалах человека и множеством заболеваний, в связи с чем микроРНК активно исследуются в качестве потенциальных биомаркеров. Концентрация микроРНК в биоматериалах низкая (фМ-пМ диапазон), при норме и патологии концентрации некоторых микроРНК могут отличаться слабо, а различные микроРНК высокогомологичны. Отсюда прослеживается потребность разрабатывать высокочувствительные и высокоспецифичные методы определения микроРНК. Для определения микроРНК в настоящее время чаще других применяется ПЦР в реальном времени. Однако данный метод не лишен недостатков, в связи с чем разрабатываются альтернативные с применением изотермических амплификаций различного типа, в том числе и без применения полимераз, что является экономически выгодным. Важным преимуществом изотермических методов амплификации является возможность сочетания многих из них с высокочувствительными детектирующими системами. Одной из таких систем можно по праву назвать микропланшетный анализ с применением пероксидазы хрена и реакции усиленной хемилюминесценции. Такая система нашла широкое применение в ИФА, благодаря чему ее дополнительными преимуществами выступают коммерческая доступность и возможность автоматизации. С использованием данной детектирующей системы в сочетании с бесферментной изотермической реакцией каталитической сборки шпилек и амплификационной реакцией с полимеризацией и замещением (АМПЗ) нами были разработаны высокочувствительные методы определения кандидатов в онкомаркеры микроРНК-141 и микроРНК-155. Оба использованных метода амплификации основаны на взаимодействии микроРНК с захватывающим зондом шпилечной структуры, что делает разработанные нами методы также высокоспецифичными. Для метода определения микроРНК с применением АМПЗ проведено исследование выбора полимеразы с целью максимизации чувствительности анализа. Продемонстрирована применимость разработанных методов для анализа микроРНК в клетках раковых линий человека (MCF7, HeLa, HEPG2, CaCo2).
Speaker
Bodulev Oleg
MSU
Russia
Discussion
Ask question
