Fluorescence of chlorosomal extracts bacteriochlorophylls (Bchl d and Bchl e) green sulfur bacteria
Rymar V.V. (1), Zhiltsova A.A. (1), Krasnova E.D. (2), Voronov D.A. (3), Patsaeva S.V. (1)
(1) Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, физический факультет, Москва,
(2) Беломорская биологическая станция имени Н.А. Перцова Биологического факультета МГУ, Москва,
(3) Институт проблем передачи информации имени А.А. Харкевича РАН; НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ, Москва,
Abstract
Оптические характеристики воды стратифицированных озер Белого моря представляют интерес в связи с наличием тонких цветных слоев в области хемоклина, появляющиеся благодаря массовому развитию аноксигенных фототрофных бактерий. Для хлорофилл-содержащих микроорганизмов (водоросли, цианобактерии) разработан ряд спектральных методик определения хлорофилла или каротиноидов, однако спектральные характеристики пигментов бактерий – бактериохлорофиллов (Бхл) пока еще плохо изучены. В природной воде отделяющихся озер Беломорского региона в бескислородной зоне могут встречаться различные аноксигенные фототрофные бактерии, поэтому в экстрактах, приготовленных из природной воды, могут одновременно присутствовать несколько типов Бхл. В данной работе были изучены спектры флуоресценции экстрактов Бхл двух типов (Бхл d и Бхл e зеленых серных бактерий) и их смеси, а также по этим данным предпринята попытка одновременного определения концентраций двух типов Бхл. Работа с экстрактами предполагает большую точность, чем с живым клетками, так как концентрация пигментов в экстракте не меняется в связи с жизненным циклом бактерий, а их флуоресценция не зависит от состояния и реакций фототрофных бактерий на среду. Спектры испускания и возбуждения флуоресценции измерены с помощью флуориметра Solar СM2203 для экстрактов индивидуальных Бхл и их смеси с различным процентным содержанием двух типов фотосинтетических пигментов - Бхл d и Бхл e. Для флуоресценции экстрактов индивидуальных Бхл при возбуждении длинами волн короче 620 нм наблюдаются перекрывающиеся полосы в спектрах испускания Бхл с максимумами при 664 нм (главный максимум) и 723 нм для Бхл d и 660 нм (главный максимум) и 715 нм для Бхл e; положение максимума в спектре испускания не зависит от длины волны возбуждения. Спектры возбуждения флуоресценции Бхл d и Бхл e оказались различными. Для определения концентрации Бхл d и Бхл e по спектрам флуоресценции экстрактов получены два линейных уравнения, основанные на различии интенсивности в спектре испускания флуоресценции Бхл d и Бхл e при возбуждении на длине волны 425 и 460 нм. Решение системы уравнений с использованием средней интенсивности флуоресценции на длинах волн испускания 660-664 нм при возбуждении поочередно двумя длинами волн возбуждения 425 и 460 нм позволяет определить концентрацию каждого пигмента в отдельности. Проверка метода для смеси пигментов в известном соотношении показала приемлемую точность 25% определения концентрации Бхл d и Бхл e при их одновременном присутствии в смеси. Таким образом, данный метод применим для определения концентраций отдельных Бхл в смеси экстрактов по спектрам флуоресценции Бхл, измеренным поочередно с использованием двух длин волн возбуждения. Работа поддержана грантом РФФИ №19-05-00377, а также Фондом развития теоретической физики и математики «БАЗИС».
Speaker
Valeriya Rymar
Lomonosov MSU
Russia
Discussion
Ольга
Здравствуйте.
У возник ряд вопросов к вашей работе.
1) Какие практические применения имеет разработанный вами подход? Зачем необходимо различать эти типы бактерий?
2) Вы подчеркиваете, что работать с экстрактами намного удобнее, поскольку вы не связываетесь с циклом жизнедеятельности бактерий и т.п. Но насколько ваш подход применим к работе с природными суспензиями? Не слишком ли вы упрощаете модель объекта исследования? Ведь в реальных пробах помимо интересующих вас бактерий может еще что-то плавать. Что-то, что может дать флуоресцентный вклад в изучаемые спектры.
3) Почему при вычислении концентраций бактерий вы не учитываете взаимодействия между бактериями? Почему вы считаете, что флуоресцентные вклады просто суммируются?
4) Не кажется ли вам, что использование большего числа длин волн возбуждения в том числе позволило бы снизить ошибку определения концентрации бактерий? А то ошибка в 25% кажется великоватой.
С нетерпением жду ваших ответов.
Valeriya Rymar
1) Это необходимо для исследования меромиктических озер Белого моря, в основном для биологических исследований.
2) Работа с экстрактами позволяет работать с выделенным из клеток бактериохлорофиллом. Так как количество бактериохлорофилла пропорционально количеству умерших клеток, то можно спокойно считать концентрацию и проводить измерения.
Работа с природными суспензиями уже проводилась ранее:
Количественное определение бактериохлорофиллов d и е в экстрактах при совместном присутствии зелено- и коричневоокрашенных зеленых серобактерий в образцах природной воды / О. Н. Лунина, A. A. Жильцова, П. С. Емельянцев и др. // Микробиология. — 2019. — Т. 88, № 6.
3) Бактерий уже нет, в экстракте они погибают, поэтому их взаимодействие можно не учитывать.
4) Эти две длины волны были выбраны по спектрам возбуждения флуоресценции, чтобы при снятии спектров испускания 1 бактериохлорофилл давал максимальную интенсивность, а второй при той же длине волны возбуждения давал минимальную интенсивность, и наоборот.
Ошибку можно уменьшить в процессе измерений, она сильно увеличилась из-за эффекта внутреннего фильтра. Но, увы, ввиду карантина переделать измерения не было возможности.
Ask question
